杂志：Journal of Translational Medicine

影响因子：6.1

研究概述：

葡萄黑色素瘤（UM）是一种罕见且致命的眼癌，具有很高的转移潜力，尽管肿瘤微环境中恶性细胞占主要地位，但肿瘤内异质性（ITMH）异质性和潜在的分子特征仍有待充分表征。 作者分析了来自17例UM肿瘤的37660个恶性细胞的单细胞转录组学数据， 发现肿瘤内和肿瘤之间的恶性细胞间存在多种亚群和转录变异性。 作者观察到恶性细胞状态和组成异质性与基因组、免疫学和临床特征相关。随后通过单细胞水平上鉴定与恶性细胞异质性相关的基因表达模型，作者将UM样本分为两种不同的肿瘤内亚型（ITMHlo和ITMHhi），这两种亚型之间具有不同的预后和免疫微环境。 最后该研究通过机器学习开发了由九个基因组成的基因特征，该特征可用于患者分层。

研究结果：

ScRNA-seq分析揭示了UM肿瘤内和肿瘤之间恶性细胞的转录异质性

作者的研究纳入了两个队列的17例UM肿瘤的scRNA-seq数据，在质量控制和双峰去除后，保留51464个高质量单细胞用于后续分析。为了揭示UM的细胞组成，作者根据其经典标志基因对七种主要细胞类型进行了聚类和鉴定，包括恶性细胞、感光细胞、内皮细胞、成纤维细胞、T/NK细胞、B /浆细胞和髓样细胞（图1a-c）。差异表达分析和相关性分析，根据细胞前10个簇特异性基因确定了细胞簇之间的关系，其中恶性细胞簇均表现出高度相似性，但被划分为不同的子模块，表明恶性细胞的转录多样性（图1d）。进一步分析恶性细胞的转录组，作者它们分为19个簇（图1e）。尽管观察到患者特异性的恶性细胞，但来自同一患者的恶性细胞也被映射到不同的恶性细胞亚簇中，这意味着同一肿瘤内恶性细胞的肿瘤内转录组异质性（图1f-g）。作者将 17 例患者分为两组，以中位多样性评分为临界值，瘤内恶性细胞异质性高 （ITMHhi）有8例和低瘤内恶性细胞异质性 （ITMHlo）有9例（图1g）。这两种亚型对应于不同的临床行为，ITMHhi 肿瘤表现出更大的肿瘤直径、混合的组织病理学特征、GEP 2 级亚型和更高的转移风险。伪时间轨迹分析观察到了ITMHlo 肿瘤细胞到 ITMHhi 肿瘤细胞的肿瘤细胞进化趋势（图1h）。

肿瘤内恶性细胞转录异质性与患者预后的临床相关性

作者对ITMHhi 和 ITMHlo 肿瘤之间的恶性细胞进行了差异表达分析，以确定与恶性细胞异质性相关的表达特征（图2a）,共鉴定出120个ITMH相关DEGs，包括78个ITMHhi 特异性基因和 42 个 ITMHlo 特异性基因。通路富集分析显示，ITMHhi 特异性基因在应激反应、血管形态发生、细胞死亡和细胞增殖相关的通路中过度表达，而 ITMHlo 特异性基因主要富集在细胞生物合成过程和有氧呼吸中（图2b）。随后，作者将每位患者 ITMH 相关基因表达水平的缩放 t 检验统计值作为 ITMH 评分，将 UM 患者分为两种不同的 ITMH 亚型。具体来说，ITMHhi 亚型 （n = 43，ITMH 评分 > 0） 由高度异质性的恶性细胞组成，其特征是 ITMHhi 特异性基因特征高表达和 ITMHlo 特异性基因特征低表达，而 ITMHlo 亚型 （n = 37，ITMH 评分 < 0） 由具有低异质性的恶性细胞组成，其特征是 ITMHlo 特异性基因特征高表达和 ITMHhi 低表达特异性基因特征（图2c）。在患者预后方面，ITMHhi 亚型患者的总生存期（图2d） 和无进展生存期（补充图）均显著差于 ITMHlo 亚型患者。此外，作者在另一个队列（Laurent 队列）中验证了他们的发现，其中 63 名患者被分为 ITMHhi 和 ITMHlo 亚型（图2e），观察到总生存期的显著差异（图2f）。最后，多变量 Cox 回归分析表明，ITMH 分类和 ITMH 评分是生存的可靠预测因子，与临床/组织病理学变量无关（图2g）。接下来，作者研究了 ITMH 亚型与先前定义的 GEP 分级以及 SCNA 集群之间的关联。结果显示，来自不同 GEP 类别或 SCNA 集群的 UM 患者可以进一步分为不同的 ITMH 亚型（图2h）。

肿瘤内恶性细胞异质性相关的分子特征

作者观察到与 ITMHlo 肿瘤相比，ITMHhi 肿瘤的恶性细胞中 3 号染色体频繁缺失和 8 号染色体增加（图3a），TCGA-UM队列数据也显示ITMHhi 患者与更高比例的基因组改变 （FGA） 相关，在 ITMHhi 患者中观察到染色体 3、6q、8p、16q的拷贝丢失，染色体 4p 和 8q 的拷贝增加（图3b）。GISTIC 分析在 3q28 处发现了一个明显的丢失峰，其中包括几个已知的 GEP 2 类下调特征（FXR1、EIF1B、ROBO1、LMCD1、SATB1）和 BAP1（图3c）。作者使用NMF算法来识别scRNA-seq队列中17例患者种单个细胞优先共表达地连贯基因集，该分析产生了88个基因特征， 这些特征经过分层聚类后出现了五个不同的转录组学program（图3d）。Program 1 参与氧化磷酸化 （UQCRQ 、 NDUFA4 、 COX6C）；Program 2 的特征是被不同的刺激和应激反应激活的早期基因 （FOSB 、 JUNB 、 FOS）；Program 3 在线粒体基因中富集；而Program 4 与免疫反应相关，MHC 基因 （HLA-A、HLA-B、HLA-C）出现上调；Program 5 包括缺氧相关基因（GAPDH、LDHA、ENO1）（图3e）。在转录组项目富集分数与肿瘤恶性细胞异质性的关系上，ITMHhi 肿瘤中的应激 （program-2） 和免疫反应 （program-4） 之间存在很强的相关性，而 ITMHlo 肿瘤表现出线粒体富集程序 （program-3）的特征(图3f)。这在TCGA-UM队列中也得到验证，其中ITMHhi 患者的Program 2 和 4 的Program评分明显更高，而 ITMHlo 患者中Program 3 评分更高（图3h）。

肿瘤内恶性细胞异质性与免疫微环境重编程的关系

为了评估肿瘤内恶性细胞的异质性是否可以重塑TME内的免疫相关特征和细胞组成，作者对UM中的免疫细胞类型进行了详细分析。通过重新聚集并鉴定T/NK细胞的五个不同亚群（CD4 T、CD8 Tex、Prol Tex、NK 和 Treg）、髓系细胞的三个亚群（TAM、单核细胞和 DC）和两个 B/血浆细胞亚群（图4a），作者发现，ITMHlo 和 ITMHhi 肿瘤之间免疫微环境的差异主要来源于 T 细胞的浸润变化（图4b）。ITMHhi 肿瘤表现出更高的 CD8 Tex、Prol Tex 和 Treg 细胞浸润（图4b），耗竭水平和免疫抑制评分增加（图4c），表明ITMHhi 肿瘤中存在高度免疫抑制的肿瘤微环境，具有较弱的 T 细胞介导的杀伤能力。作者还使用 CIBERSORT 和 ssGSEA 对 TCGA 大量转录组数据进行了计算免疫组成估计，这证实了这些 T 细胞亚群在ITMHhi 肿瘤中的富集（图4d）。作者还使用SCENIC 方法鉴定了负责诱导 ITMHhi 肿瘤中 T 细胞表型重编程的关键转录因子 （TF），结果显示，ITMHhi衍生 T 细胞表现出激活的信号转导和转录激活因子 1 （STAT1），在 Treg、CD8 Tex 和 Prol Tex 中显著上调（图4e）。此外，配体-受体信号传导推断出来自 ITMHhi 肿瘤的恶性细胞比来自 ITMHlo 肿瘤的恶性细胞表现出更多的外向相互作用（图4f），与 ITMHlo 肿瘤相比，恶性细胞分泌的人类白细胞抗原 （HLA） I 类分子与 ITMHhi 肿瘤 TME 中免疫细胞上表达的受体（CD8A 和 CD8B）有更多的相互作用（图4g）。

生成和验证用于定义UM肿瘤细胞内在亚型分类和预测生存的基因特征

基于对 ITMHhi 和 ITMHlo 肿瘤之间的恶性细胞进行单细胞分析获得的 DEGs，作者利用单因素cox回归评估了每个ITMH相关DEG的预后价值，保留|HR| > 1的基因，在剔除高相关性最高的基因后，作者进行递归特征消除方法再次进行特征选择，最后使用XGBoost算法识别有价值的特征，并训练XGBoost分类器用于TCGA-UM队列中的亚型确定（图5a）。最后，作者在三个多中心 UM 队列中独立验证了 9 基因特征，他们可以将患者分配到 ITMHhi 或 ITMHlo 亚型。生存分析显示，预测的 ITMHhi 亚型患者的生存期明显短于预测的 ITMHlo 亚型的患者（图5b）。

研究总结：

在该项研究中，作者通过整合单细胞RNA-seq和转录组学分析，揭示了UM肿瘤内恶性细胞的转录多样性和异质性，通过利用恶性细胞的异质性基因表达模式，鉴定了具有不同分子、生物学和临床特征的UM肿瘤细胞内在亚型。 此外，作者根据这两个亚型之间的差异基因表达情况，建立和验证了一个9-基因特征，该基因特征不仅可以运用于普通转录组学数据，还可以将单细胞数据信息翻译成组织转录组学。