摘要

背景：白细胞介素17家族细胞因子是癌症（CRC）发展的有力驱动因素。已经表明，IL-17主要向肿瘤细胞发出信号以促进CRC，但其潜在机制尚不清楚。IL-17也抑制Th1武装的抗肿瘤免疫，部分是通过吸引骨髓细胞进入肿瘤。然而，IL-17是否以更直接的方式控制适应性免疫细胞的活性尚不清楚。

方法：使用散发性或诱导性结直肠癌的小鼠模型，我们在全身或特异性结直肠癌细胞中消融IL-17RA。我们还进行了过继性骨髓重建，以敲除造血细胞中的CXCR3。组织学和免疫学实验方法用于揭示IL-17、趋化因子产生和CRC发展之间的联系。

结论：IL-17向结直肠癌细胞发出信号并抑制其CXCL9/10趋化因子的产生。通过这样做，IL-17抑制CD8+CTL和Tregs向CRC的浸润，从而促进CRC的发展。癌症免疫疗法可通过使用抗IL-17药物作为辅助疗法而受益，这些药物可阻断IL-17介导的肿瘤促进和T细胞排斥

1.IL-17 inhibits the infiltration of tumor-associated CD4+ T cells and the production of IL-10 and TGF-β

IL-17抑制肿瘤相关CD4+T细胞的浸润及IL-10和TGF-β的产生

使用散发性和诱导性CRC的小鼠模型，我们开始了解IL-17如何调节适应性免疫。散发性CRC的小鼠模型基于结肠上皮细胞中一个拷贝的Apc肿瘤抑制基因的等位基因失活，该基因由Cdx2Cre转基因（Cdx2Cre+/ApcF/+）驱动。随后的Apc杂合性缺失（LOH）导致肠道中大结肠腺瘤和腺癌的发展。该模型中的肿瘤仅限于结肠和直肠，并发展为腺癌，这使得该模型与人类CRC比常用的ApcMIN小鼠更相关，因为大多数肿瘤都在小肠中发展。作者还使用了第二种同步结直肠肿瘤发生模型[25]，该模型依赖于他莫昔芬诱导的Cdx2-Cre-ERT2+/ApcF/F小鼠中Apc基因的消融，从而可以研究早期结直肠肿瘤的发生。早期CRC病变可在注射他莫昔芬后1周进行组织学检查。如果没有中断，这些早期病变在4周后发展为可见的结直肠肿瘤。使用这些工具，我们发现IL-17抑制IL-10和TGF-β的产生，这两种物质都限制Th17活性并抑制CRC的发展。IL-10和TGF-β由肿瘤内的多种免疫细胞和基质细胞产生，包括Tregs。在散发性CRC模型中，IL-17RA的消融导致Foxp3水平升高，Foxp3是Tregs的关键标志物（F1A）。由于作者之前的研究表明IL-17对早期CRC病变的生长至关重要，作者还检测了直径仅为1至2mm的早期CRC肿瘤中IL-10和TGF-β1的水平。IL-17信号传导的消融导致IL-10和TGF-β1mRNA水平显著增加（超过10倍）（F1B），并显著诱导肿瘤中Foxp3的表达（F1B），表明IL-17信号在早期CRC抑制抗炎细胞因子产生中发挥重要作用。TGF-β1由肿瘤微环境中的多种细胞类型产生，而IL-10的产生似乎仅限于CD4+T细胞（F1C）。在早期CRC病变、IL-17信号传导的消融导致CD4+T细胞向肿瘤的募集增加，以及Foxp3+（Tregs）或Foxp3-（Tr1细胞）的IL-10+CD4+T淋巴细胞数量增加（F1D、E）。这些数据表明，IL-17在早期CRC中抑制Treg细胞的浸润和抗炎细胞因子的产生。

2.IL-17 inhibits the infiltration of CTLs in early stage CRC

IL-17抑制早期CRC中CTL的浸润

作者之前已经表明，IL-17抑制Th1/Tc1特征基因的表达。这可能是由于IL-17介导的对CD8+CTL向CRC渗透的抑制。事实上，冷冻切片结肠肿瘤的免疫染色显示，IL-17RA的消融导致散发性结肠肿瘤中CD8+T细胞数量的显著增加（F2A、B）。为了测试IL-17对CTL浸润的抑制是否发生在早期CRC中，我们对三苯氧胺诱导的结肠上皮Apc缺失后发生的肿瘤进行了流式细胞术分析。该模型中IL-17RA的缺失也导致肿瘤中CD8+CTL数量的显著增加（图2c），证明了IL-17信号在限制早期结肠肿瘤中CTL浸润中的抑制作用。失去IL-17RA的早期肿瘤也表现出IFN-γ和TNF-α的表达升高（图2d）。IL-17信号传导对T细胞产生IFN-γ和TNF-α没有直接影响（图2e）。由于CD8+CTL长期以来已知在癌症免疫监测中发挥作用，观察到的IL-17对CD8+T细胞浸润的抑制与IL-17在促进早期CRC发展中的作用一致。

3.IL-17 suppresses the expression of CXCL9,10, and 11

已知IL-17可促进趋化因子的产生和MDSCs对肿瘤的吸引力。小鼠IL-17RA的消融导致肿瘤内CXCL1和2水平降低。与IL-17在促进CXCL1/2产生和骨髓细胞募集中的已知作用一致。IL-17是否调节T细胞募集尚不清楚。我们发现IL-17信号传导的缺失导致结肠肿瘤中T细胞趋化因子CXCL9、10和11的水平增加（F3a,b）。IL-17信号传导的缺失也增加了CXCR3的表达，CXCR3是CXCL9/10/11趋化因子的同源受体，可能反映了表达CXCR3淋巴细胞向肿瘤的募集增加（F3a）。在接受抗IL-17A中和抗体腹膜内注射的小鼠的5个月大的CRC肿瘤中也观察到趋化因子CXCL9家族的上调，证明了急性IL-17A阻断对趋化因子产生的影响（F3C）。与IL-17在CRC早期抑制T细胞浸润的观点一致，诱导的结直肠肿瘤发生的小鼠模型导致早期CRC肿瘤中CXCL9家族趋化因子升高（F3D）。

4.IL-17 signals to transformed colonic epithelial cells to suppress the production of CXCL9, 10, and 11

作者之前已经表明，IL-17主要向转化的结肠上皮细胞（肿瘤细胞）发出信号，以促进CRC的发展[1]。同样的信号通路也可能控制CXCL9家族趋化因子的产生。为此，我们分析了CXCL9家族趋化因子在携带IL-17RA的结肠上皮细胞特异性缺失的Cdx2Cre+/ApcF/WT小鼠中的表达。IL17信号的丢失，对于结肠上皮和他们的转化导致了CXCL9家族趋化因子的表达上调（F4a）。为了证实IL-17对趋化因子产生的直接抑制作用，我们从Cdx2 Cre ERT+/ApcF/F小鼠中分离出肿瘤细胞，并在Matrigel中培养这些细胞以形成肿瘤球体。用重组IL-17A、C或F处理这些肿瘤球，然后通过q-RT-PCR分析趋化因子的表达。与先前已知的IL-17在促进骨髓细胞趋化因子产生中的作用一致，用重组IL-17治疗导致CXCL1和2水平升高（F4B）。然而，在原发性肿瘤球体中，IL-17刺激导致CXCL9和10mRNA水平降低（F4B），从而证实了IL-17对CXCL9/10产生的直接抑制作用。

5.CXCR3 signaling attracts CTLs and Treg cells to inhibit CRC development

CXCL9和10由肿瘤细胞和肿瘤过滤髓系细胞表达，其受体CXCR3仅限于T淋巴细胞（F5A）。我们推断，这种趋化因子途径可能是IL-17在T细胞迁移到CRC中的抑制作用的原因。事实上，通过骨髓重建的方式消融所有血细胞中的CXCR3导致CD8+T细胞的募集减少，并且在较小程度上导致Tregs向结直肠肿瘤的募集减少（F5B、C）。血细胞中CXCR3的消融也降低了肿瘤中IL-10和TGF-β的水平（图5d），这两种物质都被证明可以通过抑制促瘤炎症来抑制CRC的发展。CXCR3消融也导致肿瘤中Foxp3水平的显著降低（图5d），表明CXCR3缺失后Treg募集减少。造血细胞中的CXCR3信号传导对于Th1、Th17和髓系细胞向结直肠肿瘤的募集是可有可无的（SF1）。骨髓细胞中CXCR3的消融对肿瘤中IL-17的表达没有影响，并导致IFN-γ水平升高（F5D）。CXCR3的缺失也不影响肿瘤浸润性T细胞的活化和扩增（SF2）。与已知的CD8+CTL在限制癌症发展中的作用一致，在缺乏CD8α或Beta-2微球蛋白（MHC I复合物的亚基）的小鼠中，这些细胞的缺失均导致大肠肿瘤发展升高（附加文件1:F I g u r e S3a，b）。鉴于CXCR3在介导CD8+CTL和Treg募集中的作用，我们推断CXCR3的缺失也应导致结直肠肿瘤的加速发生。事实上，在造血细胞中缺乏CXCR3的小鼠发展出更多的结直肠肿瘤，而肿瘤大小没有变化（图5e）。CXCL9家族趋化因子的表达水平不受携带CRC的小鼠中CD8+T细胞损失的影响（附加文件1：图S3c），这表明这些细胞不是产生CXCL9家庭趋化因子所必需的。总之，这些数据表明CXCR3信号选择性地将CD8+CTL和Tregs吸引到CRC，并抑制CRC的发展。

6.IL-17 blockade upregulates the expression of immune

checkpoint markers

免疫检查点抑制剂，如阻断CTLA-4和PD-1信号传导的抗体，仅对一小部分显示微卫星不稳定性（MSI）的结直肠癌有效。鉴于IL-17在抑制CTL和Treg细胞向CRC浸润中的作用，我们接下来测试了其阻断是否会影响免疫检查点信号传导。小鼠散发性肿瘤模型中IL-17RA的消融导致CTLA-4的表达升高（F6A），这是一种在Tregs中组成性表达的细胞表面蛋白，介导其部分免疫抑制功能。此外，IL17RA无效肿瘤还表现出PD-L1和PD-L2的表达水平升高（F6A）。在用抗IL-17A的中和抗体处理的Cdx2-Cre+/ApcF/WT小鼠中观察到类似的变化（F6B）。在早期结直肠肿瘤发生的小鼠模型中也观察到CTLA-4和PD-1通路标记物的上调（F6C），表明IL-17和免疫检查点通路的拮抗作用始于CRC发展的早期阶段。我们之前已经证明，IL17RA的消融导致了INF-γ，其可以上调PD-L1的表达。IL-17信号传导不影响肿瘤浸润性CD4+和CD8+T细胞的增殖或活化（F6D）。肿瘤浸润性CD8+和CD4+T细胞都表达PD-1，并且PD-1阳性T细胞的比例在IL-17信号传导消融后适度降低（F6D）。因此，CRC中总体PD-1表达的增加可能反映了IL-17信号传导阻断后T细胞浸润的显著增加，而不是每个细胞的PD-1表达增加。CTLA-4免疫疗法已在人类癌症中进行了测试，并显示出不同的疗效。与Tregs在限制肿瘤相关炎症中的作用一致，抗体阻断CTLA-4信号传导增加了肿瘤中IL-17A的表达（F7A）。相反，在接受PD-1阻断抗体的小鼠中，IL-17的表达没有改变（F7B）。这些结果表明，CTLA-4阻断上调结直肠肿瘤中的促肿瘤IL-17。总之，我们的数据显示，IL-17向肿瘤细胞发出信号，下调趋化因子CXCL9/10的产生，这是将CD8+CTL和Tregs吸引到CRC所必需的。IL-17对CXCL9/10信号传导的抑制因此降低了抗癌免疫的活性，并促进更强的促肿瘤炎症（F7C）。

Conclusions

我们的数据显示了IL-17在抑制CD8+CTL和Tregs向CRC浸润中的新作用。这是由IL-17向结直肠肿瘤细胞的信号传导介导的，这导致CXCL9/10趋化因子的产生减少。CXCL9/10趋化因子通过其同源受体CXCR3发出信号，将CD8+CTL和Tregs募集到CRC，但对于其他T细胞和髓系细胞的募集或激活是可有可无的。通过将Tregs和CTL排除在CRC之外，IL-17促进了肿瘤促进炎症的主导地位。为此，癌症免疫疗法可能受益于抗IL-17药物的使用，因为阻断IL-17降低了肿瘤生长速率并增加了CTL的浸润，这对有效的癌症治疗至关重要。