22年2月的circ，葛均波教授和孙爱军教授团队的paper

1. Lgmn expression Increases After MI in Mice

为了确定参与endocytosis 和 intracellular trafficking的潜在基因，作者比较了MI手术后不同时间点心脏巨噬细胞的转录组数据，结果显示有11个基因在MI后早期上调(a)。而在Immgen和bioGPS databases检索了这11个基因之后，作者发现Lgmn在巨噬细胞中特异性表达(b, c)，因此可能是一个重要的潜在靶点。

Fig 1a-b： qpcr和western结果显示Lgmn在梗死后5天心脏的梗死区和border区显著高表达，在非梗死区无变化。
Fig 1c： 免疫荧光显示Lgmn主要与巨噬共定位。
Fig 1d, e： 通过对MHC-II^lowCCR2^-, MHC-II^highCCR2^-和MHC-II^highCCR2⁺巨噬的分选和qpcr，作者发现Lgmn主要在MHC-II^lowCCR2^-巨噬表达。
Fig 1f： 免疫荧光也显示梗死5天后，Lgmn不与CCR2和MHC-II共定位。
Fig 1g, h： 在此前的报道中^1,2，TIMD4是心脏组织原位巨噬细胞的marker。作者在梗死后5天的心脏中分选了TIMD4⁺ CCR2⁻原位巨噬 , TIMD4⁻ CCR2⁻巨噬和 TIMD4⁻ CCR2⁺巨噬，发现Lgmn主要在TIMD4⁺ CCR2⁻原位巨噬中表达。

2. Lgmn expression Increases in Ischemic Cardiomyopathy

作者在人的样本中也进行了检测。同样的，作者根据HLA-DR 和 CCR2 的表达将人的心脏巨噬细胞分为了 HLA-DR^high CCR2⁻, HLA-DR^high CCR2⁺ 和 HLA-DR^low CCR2⁺。和小鼠中一致，Lgmn在你缺血性心脏病样本中方新竹升高，且主要是在HLA-DR^high CCR2⁻原位巨噬中升高。

3. LGMN Deficiency Exacerbates MI

为了探究Lgmn deficiency在MI中的作用，作者使用了Lgmn knockout (KO)鼠。结果显示敲除鼠在MI术后心功能更差。随后作者使用了Lgmn^F/F×LysM^Cre鼠，得到了一样的效果。

4. LGMN Deficiency Augments Accumulation of Apoptotic Cardiomyocytes

Fig 4a-d： Tunel染色和western结果显示Lgmn^-/-鼠MI后心肌细胞凋亡增多。
Numerous reports have linked cardiomyocyte apoptosis to post-MI cardiac repair; however, studies on the fate of the cardiomyocytes after their death are comparatively lacking.
Fig 4e-f： Next, as a surrogate indicator for in vivo efferocytosis, 作者使用免疫荧光检测了Lgmn KO 和 WT 鼠MI后的心肌和巨噬共定位。作者计算了 cardiomyocyte-containing macrophages的百分比以确定 LGMN deficiency 是否增强了凋亡心肌的累积。结果显示MI后5天，Lgmn KO鼠心脏组织中cardiomyocyte-containing macrophages 的百分比显著下降。

直接看TNNI3阳性的巨噬细胞

Fig 4g-h： 随后作者用了CCR2^GFP; α-MHC-Cre; R26-tdTomato and Lgmn KO; CCR2^GFP; α-MHC-Cre; R26-tdTomato mice。也就是心肌细胞带红光，CCR2带绿光的鼠子。流式显示，Lgmn KO的鼠子，MI后组织原位巨噬细胞对心肌细胞的吞噬作用减弱（存在impaired efferocytosis）。其他两种CCR2阳性巨噬对心肌的吞噬功能没有变化。（CCR2^GFP在这里好像是个摆设）

5. LGMN Deficiency Increases Infarction Size

Lgmn^-/-和Lgmn^F/F×LysM^Cre鼠与各自的对照相比，梗死面积都增大。

6. Lgmn Is Required for the Clearance of Apoptotic Cardiomyocytes

Efferocytosis involves recognition of apoptotic cells by cell receptors and then phagocytosis and phagolysosomal digestion of the apoptotic cells.

参考：

• ❗️胞葬作用 (Efferocytosis) ：程序性死亡细胞临终前最后一站
• Science | 胞葬作用：吞噬细胞为凋亡细胞举办的盛大葬礼

Figure S5： 对Lgmn-KO 和 WT 鼠 MI后心脏巨噬进行了RNAseq，结果显示Lgmn敲除对识别凋亡细胞的受体如CD36, LRP1/CD91, BAI1, TIM4, 和 MerTK没有显著影响。

Thus, we focused on phagocytosis and phagolysosomal digestion of the apoptotic cells.
为了探究Lgmn 对 engulfment 的直接作用，作者将dying primary adult mouse cardiomyocytes (R26-tdTomato⁺)和MHC-II^low CCR2⁻组织原位巨噬细胞共培养。作者在Lgmn^−/−巨噬中观测到了2个主要现象。

1. 这些巨噬细胞存在impaired high-burden efferocytosis.

Fig 5a, b： 在早期和较低的心肌/巨噬比例下，Lgmn^−/−巨噬显示出与control类似的心肌吞噬作用。而随着共培养时间延长或心肌/巨噬比例增加的情况下，吞噬作用下降。
Fig 5c： CypHer5E-labeled cardiomyocyte-derived material的Cell Tracker也得到了一致的结果。

类似的实验在TREM2hi原位巨噬细胞通过维持心肌稳态保护脓毒心 也看到过

因此，作者推测LGMN enabled high-burden efferocytosis in macrophages by facilitating the internalization of multiple cardiomyocyte-derived material. 因此作者进行了2-stage efferocytosis experiment。作者先将巨噬与calcein AM-labeled cardiomyocyte-derived material共培养了45min，然后移除了心肌material，并让巨噬休息了120min。然后将巨噬与R26-tdTomato–labeled cardiomyocyte-derived material共孵育。

Fig 5d： 结果显示，只有一小部分的Lgmn^−/−内吞了两种心肌。

2. 第二个现象是Lgmn^−/−巨噬存在phagocytic capacity的下调，因为更少的凋亡物质被内吞和处理。

Fig 5e： 为了定量phagolysosomal cargo degradation，作者将Lgmn^−/−和control巨噬与R26-tdTomato–labeled cardiomyocyte-derived material共培养了45min，随后移除了unengulfed cardiomyocyte-derived material，在3小时后检测了巨噬细胞中的R26-tdTomato，结果显示与对照相比，大量的Lgmn^−/−中存在着nonfragmented cardiomyocyte-derived material。

7. Lgmn-Deficient Macrophages Exhibit Defective LC3-II–Associated Phagocytic Degradation

由于Lgmn^−/−巨噬细胞存在less fragmentation of the internalized cardiomyocyte-derived material，提示存在phagolysosomal cargo。因此作者探究了这种现象是否由defective LC3-associated phagocytosis所致。
Fig 5f： 作者发现LGMN deficiency引起了MI后心脏中LC3-II的下调。
Fig 5g： 此外，作者将Lgmn^−/− 和control巨噬与R26-tdTomato–labeled cardiomyocyte-derived material 共培养了1h，随后移除心肌，将巨噬细胞固定，使用digitonin去除了nonmembrane-bound LC3，对LC3进行了染色，结果显示LC3在cardiomyocyte-containing control macrophages中较多，在Lgmn^−/− macrophages 中下降。

8. Defective Phagocytic Sealing and Degradation in Lgmn-Deficient Resident Cardiac Macrophages Are linked to Decreased Cytosolic Calcium

为了探究LGMN与defective efferocytosis的关系，作者首先探究了cytoplasmic calcium 的功能（因为巨噬细胞胞内钙离子的增加对凋亡细胞的清除是必须的，而且cytosolic calcium decreases in response to defective intracellular calcium mobilization in certain settings）。作者假设LGMN缺陷可能会使凋亡细胞通过PAR2 (protease- activated receptor 2) 诱导巨噬细胞胞内钙离子增加过程受损，从而引起受损的efferocytosis。
Fig 5h： 作者首先探究了Lgmn^−/−巨噬在暴露于凋亡心肌下时是否存在胞内钙离子水平的改变。结果显示Lgmn^−/−巨噬在吞噬了凋亡心肌后，the mobilization of intracellular calcium was significantly compromised.
Fig 5i： 有文献报道胞内钙离子的增加是LGMN介导的PAR2 cleavage介导的。作者使用了PAR2 expressing an extracellular FLAG epitope and intracellular HA epitope (FLAG-PAR2- HA) 来证实Lgmn^-/-巨噬中intact PAR2在细胞膜表面被LGMN切割。巨噬细胞与LGMN (100 nmol/L, Hanks Balanced Salt Solution, pH 5.0) 共孵育，随后检测了FLAG 和 HA epitopes，结果显示在vehicle-treated macrophages中，FLAG 和 HA epitopes在胞膜共定位，而在与LGMN共孵育之后，只有 HA epitopes 被检测到。提示LGMN可以切割PAR2胞外段，引起胞内钙离子升高。

9. LGMN Deficiency Induces MHC-IIhigh CCR2+ and MHC-IIlow CCR2+ Infiltration After MI

总体上，敲除Lgmn没有引起心脏巨噬的显著变化(a)。而MI 5天后，Lgmn^-/-鼠心脏中性粒和Ly6c⁺单核增加。此外，MI 5天后，Lgmn^-/-鼠心脏 MHC-II^high CCR2⁺ 和 MHC-II^low CCR2⁺巨噬都增加(c)。但是Lgmn^-/-并没有显著影响巨噬的增殖(d)。对ll10, tgf-b, ifn-r的监测提示Lgmn KO 鼠MI后存在delayed inflammation resolution.
Taken together, these findings indicate that LGMN deficiency impaired post-MI inflammation resolution.

10. Depletion of Lgmn in Resident Cardiac Macrophages Exacerbates Cardiac Function After MI

组织原位巨噬细胞特异性敲除Lgmn (Lgmn^F/F×Cx3cr1^CreER)，MI14天后心功能更差，梗死灶面积更大，心肌细胞凋亡更多，巨噬对凋亡心肌的清除减少。

11. Lgmn Overexpression in Cardiac Macrophages Improves Cardiac Function in Mice After MI

最后，作者给使用Lgmn的AAV干预了Lgmn KO 鼠。结果显示重新表达Lgmn后，MI小鼠心功能改善，梗死灶减小，心肌凋亡细胞减少，巨噬对凋亡心肌的吞噬增强。此外，AdLgmn原位巨噬展示出增强的 high-burden efferocytosis 和增加的 phagocytic capacity。

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参考文献：

1. 文献学习094--自我更新的心脏组织原位巨噬细胞限制心梗后的adverse remodeling
2. 文献学习015--[sc]心脏原位巨噬细胞抑制纤维化和刺激血管生成