文献阅读012——Discovery of ultrapotent broadly neutralizing antibodies from SARS-CoV-2 elite neutralizers

2023-10-11 07:25 浏览:2973 搜索引擎搜索“手机低淘网”
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1. Author

Florian Klein

Florian Klein主要从主HIV为主的病毒学研究。人体免疫系统可以有效地预防和控制病毒感染。虽然许多病毒可以被中和并从人体中清除，但其他病毒在感染后仍然存在。然而，它们通常在整个人类寿命中都受到控制（例如，某些疱疹病毒，如巨细胞病毒感染）。在HIV-1感染中，免疫反应通常不足以完全抑制病毒复制，从而导致HIV疾病的持续发展。然而，很少有患者在感染后早期（如精英控制者）或停止有效的抗逆转录病毒疗法（ART）后持续控制HIV-1病毒血症。这些所谓的治疗后控制者的例子在过去几年中得到了关注，并表明干预措施，如ART治疗，可能会导致HIV-1的长期控制和功能性治愈。

2. Background

2.1冠状属病毒

背景

1965年，从一名感冒患者的鼻腔分泌物中分离出第一种人类冠状病毒（HCoV）B814株。自那以后，陆续发现了30多个菌株。其中，HCoV-229E（以学生标本编号229E命名）是使用标准组织培养分离的。HCoV-OC43（因43号器官培养得名）后来使用气管器官培养物恢复，并发现在血清学上与HCoV-229E不同，这两种病毒是HCoV研究的重点。后来随着SARS-CoV的出现，又鉴定出两个HCoV。HCoV-NL63（Netherland63）于2004年从一名患有支气管炎的婴儿吸出物中分离，而HCoV-HKU1（Hong Kong University 1）于2005年从香港一名肺炎患者中分离。此后，又出现了两种人畜共患HCoV，即中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）和2019年新型冠状病毒（2019-nCoV，又称SARS-CoV-2）。

冠状病毒分类

冠状病毒结构

刺突蛋白（Spike，S）属于Ⅰ型跨膜蛋白，分子大小为150-200 kDa。因为其可以被宿主蛋白酶切割成两个亚基，故将其命名为S1、S2。胞外段的S蛋白被二硫键修饰而短小的胞内段被棕榈酰化。S蛋白被认为是病毒入侵宿主的关键因素同时也是引发ER压力反应的诱因。

血凝素酯酶（HE）也是Ⅰ型跨膜蛋白，通过二硫键形成同源二聚体。HE蛋白具有唾液酸结合血凝素活性，可作为S蛋白的辅因子，促进病毒颗粒的附着。由于它具有从O-乙酰化唾液酸中去除乙酰基的酯酶活性，因此被认为具有受体破坏作用，促进子代病毒粒子从宿主细胞中释放，从而增强病毒粒子在细胞外环境中的传播。

M蛋白(25-30 kDa)是最丰富的结构蛋白，具有三个跨膜结构域。HCoV-OC43和一些动物冠状病毒(包括小鼠肝炎病毒(MHV)和牛冠状病毒(BCoV))的M蛋白短N端外域被O -糖基化修饰。然而，在HCoV-229E、HCoV-NL63等大多数冠状病毒中，M蛋白的外结构域被N -连接糖基化修饰。M蛋白为同源二聚体，该蛋白也可能与病毒的发病机制有关。例如，视黄酸诱导基因1 (RIG-I)依赖于I型干扰素(IFN)的诱导可在SARS-CoV M蛋白过表达的细胞中观察到，而HCoV-HKU1则没有。

E蛋白是一种小的(8-12 kDa)完整膜蛋白，在病毒粒子中含量很低。SARS-CoV E蛋白通过N -糖基化修饰，其内域的3个半胱氨酸残基通过棕榈酰化修饰。此外，SARS-CoV和禽传染性支气管炎冠状病毒(禽传染性支气管炎冠状病毒，IBV)的E蛋白已被证明能形成具有离子通道(IC)活性的同源五聚体。IC活性可能调节病毒粒子的释放过程，参与病毒的发病机制。

N蛋白(43-50 kDa)形成二聚体，并以“串珠”的方式与基因组RNA结合，形成螺旋对称的核衣壳。在SARS-CoV和其他冠状病毒中，N蛋白被细胞激酶磷酸化。在一些冠状病毒的N蛋白中也发现了其他修饰。N蛋白促进RNA包装，并参与许多其他过程，包括病毒基因组复制和逃避免疫反应。

冠状病毒结构图

2.2 CD137/CD154

CD137(4-1BB)和CD154（CD40L）是两个特异性非常高的T细胞激活标志物, 在未激活的T细胞上几乎无表达，因此为分选抗原特异性T细胞提供了重要依据。

CD154 (CD40L) 在CD4+ T细胞激活4小时后会持续较长时间的高表达，因此是CD4+ T细胞活化的重要标记物。

CD137同样可在Treg细胞激活的早期(4 – 6 h)出现瞬时高表达，因此也可用于此时Treg细胞的分选标记物。

3. Methods

1. 血液、血清、血浆样本的处理

2. IgG与IgA的分离

3. 单细胞测序

4. 变异株Spike蛋白的克隆表达

5. 假毒中和实验

6. 真毒实验

7. ELISA

8. Hep-2自反应实验

9. 冷冻电镜

Hep-2自反应实验：NOVA Lite Hep-2 ANA kit是Inova Diagnostics公司生产的一种用于抗核抗体（ANA）检测的试剂盒。它是一种间接免疫荧光法（IIF）试剂盒，用于检测患者血清中的自身抗体。该试剂盒使用人类乳头瘤细胞株（Hep-2）作为底物，通过观察荧光标记的抗人IgG二抗与患者血清中的抗核抗体结合情况，来判断是否存在ANA。

4. Results

实验团队收集了一个936人的队列，发现其中只有3.3%的人群具有强大的中和反应，将其称为“Elite Neutralizer”。有趣的是这些人群的抗体对SARS-CoV-1等β冠状属的病毒同样具有良好的交叉反应性。根据对收集到的B细胞进行单细胞测序发现：SARS-CoV-2 elite neutralizers所构建的多克隆抗体应答具有高度IGHV序列相似性。其中IGHV3-53和IGHV3-30-3的序列优势性格外突出，也就是说这些抗体应答具有趋同进化特征。

SARS-CoV-2抗体库重链CDRH3序列相似性分析

实验团队对分离得到的单克隆抗体进行功能性鉴定，陆续开展了ELISA、假毒、真毒实验。发现：① 42.8%的抗体靶向于RBD结构域，且这些RBD抗体98.1%为中和抗体。② 因为S2的高度保守性，靶向于S2的抗体几乎都是交叉抗体。 ③ 自反应性的抗体极少。

抗体功能实验结果图

因为新冠病毒得高突变性，探究分离得到抗体得中和广度意义非凡。紧接着，作者团队用这57个中和抗体对5类变异株（B.1、B.1.1.7、B.1.351、B.1.429、B.1.617和B.1.617.2）以及各突变位点做了详细的结合实验。发现：① 以R200-1B9为代表的23个抗体可以中和目前出现的5中突变株。而目前的临床抗体（REGN10933等）只能中和80%左右的突变株。 ②对体细胞高突变率和CDR3重链和轻链序列长度的评估表明，这些中和抗体的体细胞高突变水平略高，CDRH3较短。③ 在这23个中和抗体中，有8个(35%)抗体都是利用IgHV3-53/IgKV1-9 ④ 相比于临床抗体，这些广泛的中和的效价明显更加优秀。 ⑤来自elite neutralizers的中和抗体对可能出现的突变位点（R346S/Q414H/N440K/T478K）也存在着很好的中和作用。

筛选抗体的中和情况

之前的零星研究已经表明IGHV3-53与IGKV1-9的组合足有良好的中和效应。首先，RBD抗体根据其结合表位以及其结合“up”或“down”RBD构象和阻断ACE2结合的能力被划分为4类。IGHV3-53抗体通常是1类或2类抗体，K417或E484位点的突变可以破坏这些抗体的功能。通过表位竞争实验可以发现R40-1G8主要竞争的是1类或2类抗体。进一步的冷冻电镜实验表明：①R40-1G8与RBD的相互作用主要是通过重链的16个残基而轻链的6个残基介导的。通过1类(C102和C105)和2类(C002)的复杂结构的结构比对发现，R40-1G8与C102或C105类似的表位结合，表明它是一类抗体。②一般以C102为代表的1类抗体只能结合“up”的构象，但是R40-1G8可以结合“up”“down”的构象。③ 此外，许多IGHV3-53抗体，如C102与短CDRH3是受K417突变的影响，但尽管R401G8具有类似的结合模式和CDRH3长度，但K417E/N/T突变并未影响R401G8。④C102结构中的K417位点形成的是pi键，但是在R40-1G8结构中的K417没有这种相互作用；R401G8也不受另一个关键突变N501Y的影响。

R40-1G8与RBD的结合模式图